青天葵组培物超低温保存研究【【花卉大全】青天葵组培物超低温保存研究】【摘要】目的用超低温方法保存青天葵组培物 。 方法采用单因子比较法、均匀设计法考察生长周龄、冷冻保护剂、预培养时间、降温方式、化冻方式等因素对青天葵组培物超低温保存后细胞生活力的影响 。 结果青天葵组培物较佳的超低温保存程序为：５周龄的组培物，在４℃进行低温锻炼１２ｄ，以１２．５％ｄｍｓｏ＋０．２５％ｌｈ为冷冻保护剂，在４℃静置处理３０ｍｉｎ，然后在－１８℃，停留１ｈ后投入液氮中保存，材料取出后，在２０℃化冻，无菌洗涤后，再接种，组培物能够存活并继续生长 。 结论超低温保存方式可以成功保存青天葵组培物种质资源 。
青天葵别名独叶莲、青莲、天葵、芋兰等，来源于兰科多年生宿根草本植物毛唇芋兰nerviliafordii（ｈａｎｃｅ）ｓｃｈｌｔｒ．，以叶或带块茎的叶入药［１］，有清肺止咳、健脾消积、镇静止痛、清热解毒、散结消疬之功效，主治肺痨、咳嗽咳血、瘰疬、肿毒、跌打损伤、小儿疳积、精神病、口腔炎、急性咽喉炎等，对小儿肺炎有特效 。
由于青天葵种子无胚乳，仅靠无性繁殖，自然繁殖数量少，繁殖系数极低，资源分布极其有限 。 多年来，因乱采乱挖，多是连叶带块茎采挖加工，导致野生青天葵资源日益枯竭 。
我们已经开展青天葵组织培养及植株再生的研究工作［２］，本研究青天葵组培物超低温保存的影响因素，为青天葵资源再生和种质保存提供技术资料和理论依据 。
１材料与方法
１．１材料本实验所用青天葵组培物是由青天葵球茎诱导产生的根状茎 。 在含有６－ｂａ２ｍｇ?ｌ－１的ｍｓ培养基上进行继代培养 。 培养温度（２５±２）℃，每天光照１２ｈ，光照强度１２００ｌｘ 。 经不同周龄对比试验后，采用５周龄的组培物作为超低温保存的试验材料 。
１．２方法
１．２．１冷冻保护剂考察ｄｍｓｏ，ｇｌｙ（甘油），ｐｅｇ（聚乙二醇），ｓｕｃ（蔗糖），ｇｌｕ（葡萄糖），ｌｈ（水解酪蛋白）６种冷冻保护剂及其不同浓度配比的冷冻保护效果 。
１．２．２预培养将组培物转至含５％ｄｍｓｏ（二甲基亚砜）的ｍｓ培养基上，置于４℃进行零上低温锻炼 。 考察在此条件下预培养时间对超低温保存后细胞生活力的影响 。
１．２．３冷冻程序将组培物放入５ｍｌ聚乙烯塑料冷冻管中，加入０℃预冷的保护剂，使之淹没组培物，旋紧管塞，在４℃静置处理３０ｍｉｎ 。 然后将冷冻管放入－１８℃，停留一定时间后投入液氮中保存 。 考察在－１８℃温度下停留不同时间（０．５，１，２，３，４，５，６，７，８ｈ），对超低温保存后细胞生活力的影响 。
１．２．４化冻与洗涤材料从液氮中取出化冻 。 考察不同的化冻方式：４℃零上低温，１０，２０，３０，４０，５０，６０，７０℃的化冻效果 。
待冷冻管中的冰融化后，立即加入ｍｓ培养液（大量元素＋３％蔗糖），轻轻振摇，停留１０ｍｉｎ，倾出溶液，如此反复洗涤３～５次 。
１．２．５细胞生活力的检测按简令成［３］报道的方法：称取洗涤后的组培物２００ｍｇ，加入５ｍｌ氯化三苯四氮唑（ｔｔｃ）液，在黑暗条件下静置染色２０ｈ 。 吸去ｔｔｃ液，用蒸馏水洗涤３次 。 加入丙醇研磨提取ｔｔｃ被脱氢酶还原后生成的红色甲 。 用７５５型分光光度计，在４９０ｎｍ处测试丙醇提取液的吸收值 。 用这个吸收值（ｔｔｃ）值表示各处理的愈伤组织经超低温保存后的细胞生活力 。
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