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质粒dna 质粒DNA转染成功的关键点？

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转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术 。利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞 。随着基因与蛋白功能研究的深入质粒dna，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法 。

质粒dna 质粒DNA转染成功的关键点？

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质粒dna 质粒DNA转染成功的关键点？

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质粒DNA转染成功的关键事项：
1.保证转染过程中质粒DNA的高纯度和高质量 质粒DNA应主要是超螺旋状的，不含基因组 DNA 和 RNA；应高度浓缩，不含苯酚，盐和蛋白质；不含内毒素；是正确的序列 。
2.转染试剂 RFect siRNA转染试剂是一种采用新型的动物源性的纳米材料，毒性很低并且拥有非常卓越转染性能的一种小核酸转染试剂，细胞转染阳性率高达90%以上，基因敲除效果明显 。
用乙醇沉淀法浓缩质粒DNA：
提取液中加入等体积预冷的5mol/L Licl 充分混匀，1000rpm 4℃离心15min，取上清 。
加等体积异丙醇，混匀，室温放置10min，10000rpm 4℃离心15min 。
弃上清，纯点加入70%乙醇洗涤一次，沉淀风干10~15min 。
500ul，含RNA酶的TE（pH8.0）溶解沉淀，室温放置30min 。（将质粒RNaesA混合物用酚：氯仿抽提一次，然后用氯仿抽提一次）
用2.5倍体积无水乙醇沉淀质粒，风干10min 。
加1ml灭菌水溶解沉淀，加500ul PEG-MgCl2溶液，充分混合，室温10min，12000rpm 4℃离心15min 。
用70%乙醇重悬沉淀，12000rpm 4℃离心15min 。
弃上清，沉淀用70%乙醇处理一次，最后将质粒，溶于500ulTE（pH8.0）中，取1ul质粒DNA，100倍稀释后测OD260，计算DNA的浓度，其余封装，-20℃保存备用 。
从名字上就可以看出异同：
【质粒dna 质粒DNA转染成功的关键点？】同：都是作为载体，将目的序列递送到靶细胞内部 。
异：
根本性质不一样：一个是质粒DNA，一个是病毒；
进入细胞方式不一样：质粒通过转染进入目的细胞，病毒通过感染进入目的细胞，特异性更强，且效率更高；
所搭载的序列形式及其发挥功能的方式可能不一样：质粒DNA所搭载的目的序列是DNA，并且DNA通常需要进入细胞核才能行使相应的功能；病毒载体搭载的序列可以是DNA，也可以是RNA，而RNA序列通常不需要入核行使功能，并且如果是进行宿主基因组的同源重组，病毒载体效率更高 。
包装方式不一样：质粒通常是在原核细胞内进行扩增后提纯；病毒载体通常在真核细胞内包装后逐步扩大培养后裂解细胞/收集上清后提纯获得 。
保存方式不一样：质粒通常稳定性非常好，对温度不敏感；病毒不一样，一般需要低温冷冻保存，对温度很敏感，反复冻融对活力影响也非常大 。
在疫苗应用中：质粒DNA作为DNA疫苗的载体，通常免疫原性较低，需要使用脂质体或者电击枪用于增强DNA进入细胞；病毒载体疫苗免疫原性较好，通常很容易诱导较强的抗体和T细胞免疫原性，但往往受限于预存免疫
首先是你的质粒拷贝数,多的当然好了.低拷贝的可以在收菌前一小时用氯霉素加压筛选下.第二看你是用试剂盒还是手提了,试剂盒的话基本没什么问题,记住几个要点就行.1）溶液2和溶液3加完后混匀要轻柔,越轻越好,否则由基因组污染.2）溶液2和溶液3最好在冰上操作.3）冷结合热洗脱,上柱时温度4度,洗脱时50度-60度.手提的话除了上述几点还要注意RNA的消除,除了LiCl沉淀以外,RNA酶也必不可少,最好37度消1小时以上.别的网上有很多相关的参考,操作时注意些没问题的.
在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体 。人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等 。常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101 。pBR322含有抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr)，并含有5种内切酶的单一切点 。如果将DNA片段插入EcoRI切点，不会影响两个抗生素基因的表达 。但是如果将DNA片段插入到Hind III、Bam H I 或 Sal I切点，就会使抗四环素基因失活 。这时，含有DNA插入片段的pBR322将使宿主细菌抗氨苄青霉素，但对四环素敏感 。没有DNA插入片段的pBR322会使宿主细菌既抗氨苄青霉素又抗四环素，而没有pBR322质粒的细菌将对氨苄青霉素和四环素都敏感 。pSC101与pBR322相似，只是没有抗氨苄青霉素基因和PstI切点 。质粒运载体的最大插入片段约为10 kb(kb表示为千碱基对) 。

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