纳豆菌的生产方法

纳豆菌种是怎么样生产的呢？这是高科技的产物，下面我们把纳豆菌的生产方法给大家简单介绍一下。
菌种Y-07为天津大学食品生物技术实验
室从吉林省朝鲜族自治区民间纳豆制品中分离、筛选和保存的菌株，经传统的生理生化特性和分子生物学鉴定[4] ，确定为纳豆菌(Bacillussubtlisnatto) ，并于LB培养基斜面保存。
1.2主要仪器与试剂
BS124S分析天平、HH.B11-40电热恒温培养箱、7230G型分光光度计等。葡萄糖、蛋白胨、无机盐类为国产试剂。
1.3培养基
斜面培养基为普通营养肉汤琼脂培养基。液体种子培养基为LB液体培养基。
4种不同碳源蛋白胨培养基分别为2%的可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖，其他成分相同，为1%蛋白胨、0.5%氯化钠， pH7.0~7.2 。固体和半固体培养基分别为加入2%和0.8%的琼脂粉。
4种不同氮源的培养基分别将氮源换为同浓度的大豆蛋白胨、胰蛋白胨、硝酸铵、硫酸铵，其他成分不变。上述培养基均采用121℃的高压蒸汽灭菌25min 。
1.4培养方法
1.4.1种子液培养取斜面菌种，接种于液体种子培养基中， 35℃ ， 180r/min摇床培养20h 。
1.4.2摇瓶发酵培养接种量2% ， 35℃ ， 180r/min摇床培养。
1.4.3制作纳豆精选优质东北大豆→清洗→浸泡过夜→蒸煮→沥干→冷却(37℃)→接种→发酵培养(35℃)→后熟→纳豆成品。发酵第24 ， 32 ， 48h进行观察。
1.5检测方法
1.5.1还原糖的测定1.3中4种液体培养基采用费林试剂法从第16h开始每隔4h测定菌液的碳水化合物浓度。
1.5.2生物量测定方法以接种前培养液为空白，测定各发酵液在600nm处的OD值。
2结果与分析
2.1不同碳源种类对纳豆菌发酵的影响
按细菌生长特点，得到的发酵液含糖量逐渐降低。在细菌的对数期，主要是因为细菌繁殖消耗碳水化合物，细菌进入平稳期后，不仅是细菌消耗，更主要是纳豆菌分泌的各种酶分解营养物质。图1中，在同一时间，不同培养液的碳水化合物浓度是不同的。其中，葡萄糖浓度随时间的延长变化最大，其次是蔗糖，麦芽糖和可溶性淀粉最小。由此判断出，在纳豆发酵时，添加适量葡萄糖，效果是最好的。但由于葡萄糖不如蔗糖经济实惠，且蔗糖和葡萄糖的浓度差异并不大，在实际发酵过程中，可适当调整葡萄糖和蔗糖的比例后加入到要发酵的大豆中，可大幅度提高纳豆的发酵率。

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在试验设计中，只涉及到了葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和可溶性淀粉，这是实验室里最常用的、最易分解的淀粉。但试验设计的目的在于改进民间纳豆的制备方法，对于商业化生产纳豆和民间制备纳豆，在经济上，这并不实惠。
纳豆生产后需低温贮藏，一般为-2～-4℃或-18℃以下。在如此低温条件下，为保持纳豆的品性，接种的纳豆菌在培养过程中，要产生大量芽孢。在培养基成分中，碳源及其浓度是影响芽孢形成的主要因素。与葡萄糖、乳糖等速效碳源相比较，在玉米淀粉、小麦淀粉等淀粉类长效碳源中，菌体生长较慢， 14～16h时生长进入平稳期，比葡萄糖、乳糖等速效碳源晚2～6h 。在芽孢形成方面，淀粉类碳源的芽孢形成缓慢[5] ，但相比于葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等糖类，玉米淀粉、小麦淀粉等淀粉类比较经济实惠。为提高产率，发酵前期可适当加入糖类物质，同时为在短时期内保证芽孢产率，要选择碳水化合物做复配发酵底物。
2.2不同培养温度对纳豆菌发酵的影响
以葡萄糖蛋白胨培养基接种后分别在25 ， 30 ， 37 ， 45℃下培养，其生长曲线如图2所示。由图2可明显看到，最佳培养发酵温度是37℃ 。虽然在45℃培养温度下培养液最早进入稳定期，但之后便一直处于一个较低的水平。37℃培养温度下，溶液的浑浊度始终比同时间培养条件下的其他培养液高， 10h后菌体则进入了稳定期和衰亡期。但是，培养温度对纳豆杆菌产生抗菌物质有较大影响，当温度为25 ， 30℃时，抗菌活性高， 35℃以上时抗菌活性下降[6] 。纳豆的营养价值在于其抑制沙门氏菌、痢疾菌及O157∶H7大肠杆菌等致病菌的作用，以及它所分泌的纳豆激酶等能够促进人体健康，因此，发酵过程需要把温度控制在35℃以下，使之保持良好的分泌生理活性物质的状态。为了保持纳豆菌的繁殖速度为最佳，试验继续采用37℃的培养温度。
2.3不同氮源种类对纳豆菌发酵的影响
将不同氮源的培养基接种培养，每隔4h测定生物量，结果如图3所示。大豆蛋白胨作为氮源时，菌株对其的利用速度较快，在16h达到最大生长量，明显好于其他3种氮源;其次是胰蛋白胨。

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而纳豆菌对无机氮源硝酸铵和硫酸铵的利72·
【纳豆菌的生产方法】纳豆的生产工艺说明
(1) 原料的处理──除去异物，粒子形整齐化
从各地收成来的原料大豆，经等级检查，合格成为原料大豆后精选处理，亦即除去夹杂物和整齐粒形，接着打包于30kg装纸袋中，贮藏于室温15℃湿度60%的低温仓库。否则大豆容易变质而质量降低。从低温仓库，提货一星期用量原料到纳豆工厂， JA以及集货地都备有原料处理厂，其设备有粗选机，除石机，研磨机，粒形选别机，色彩选别机，金属探测机等。大型工厂本身各有原料处理厂，做再度精选的工作。

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(2)洗豆、浸渍──尽量在低温
精选过的大豆用洗豆机洗净，除去附着于豆表面的沙土，尘埃和有机物，浸渍的目的为了使水份被吸收到原料大豆的子实中，软化组织，容易蒸煮，以便纳豆菌容易利用大豆成分。适度浸渍度的决定，以重量比来算，达2.3～2.4倍重量时。那时切断大豆种子时两个子实膨润到几乎没有空隙。浸渍时间依大豆品种和大小而异，但最有影响的是水温。在10℃水温要浸渍23-24小时， 15℃时17-18小时， 20℃时13-14小时， 25℃以上时7-8小时。在外面气温高的夏季，特别注意不要浸渍过度。浸渍水温高时杂菌易繁殖可达104/g大豆。虽然接下来的蒸煮工程可杀死杂菌，但其残留的代谢物质会影响纳豆菌生长，厉害时完全抑制纳豆菌的繁殖。因此尽量采取
低温抑制杂菌生长。理想状况为10℃
以下的浸渍。少量生产时在冰箱5℃浸渍，约24小时后即可蒸煮。
浸渍所需时间要看大豆粒度大小，组织状况，吸水性的好坏。要决定时间长短，将100g左右的原料大豆放入小袋子中，施行浸渍，在某个时段后取出，尽量除去水份后称量，找出其重量为原来的2.3-2.4倍的时间，浸渍不足时豆子不能蒸煮成为软软的，而无法提供充足营养分给纳豆菌。
(3) 蒸煮──依大豆品种，粒形，变更压力与时间
“蒸煮”杀死大豆表面的土壤微生物，软化大豆组织，使子实可溶成分浸到豆皮表面。因此纳豆菌接种后容易摄取营养分而纳豆菌菌体外酵素容易浸透进去，分解大豆成分。
① 先把锅炉压力提高至5kg左右。
② 将两个沙包量的浸渍大豆放入蒸煮罐中，上盖开门栓锁禁，排水阀及排气阀都开着。
③ 将锅炉中水蒸气经由蒸气配管导入蒸煮罐中。
④ 蒸煮罐的排水管一打开，进来的水蒸气先把凝结水(水蒸气碰到冷罐时产生)和大豆蒸煮产生的煮汁排出外面，接下来看到水蒸气的排出，此时关闭排水阀，再关排气阀。
⑤ 关掉排气阀10-20分蒸气压会升到1.5～2.0kg ，保持此情况30-40分钟，再关掉蒸气制阀，等10-15分，完成蒸煮。
⑥ 完成蒸煮后慢慢地开配水管及排气管阀，放出蒸气后等内外压力相等，再开盖子。
(4) 接种纳豆菌;大豆的温度最好在90～70℃之间
将纳豆菌孢子均匀附着在蒸煮大豆的表面，这作业称为接种。在日本，纳豆菌由三家提供。代表性的官城野菌为250cc玻璃瓶装液体。其5cc量即可接种大豆一沙包量。所以一瓶量足够用于50个沙包量的大豆。
液体为纳豆菌孢子的悬浮液， 1cc中大约有孢子1亿到2亿个，以1亿个来算4000个孢子附着于1g蒸煮大豆。而1300个以上孢子附着于1粒大豆表面。要把5cc原菌均一散布于一个沙包量大豆，当然事先加灭菌水增量。将煮开的饮用水冷却到50℃左右，用喷雾方式时对两沙包量黄豆，稀释到2公斤，而用浇水壶散布时就溶于2.5公升的灭菌水。
要机械蒸煮大豆时，接种时机是在从蒸煮罐把蒸煮大豆移到移动用漏斗形投入器时。而用人工充填时接种时机是在从蒸煮罐把蒸煮大豆放在塑料桶时。把准备好的稀释菌液全部用完。这是开头的菌量，而每一次都用同样的量才能维持同样发酵型式。接种时，蒸煮大豆的温度宜在90～70℃之间。温度过于降低易受杂菌污染。
(5) 装放充填工程──机械充填和人工充填
对纳豆生产不熟悉的人可能以为纳豆产品是把完成品装入容器内市售。实际上是接种纳豆菌于蒸煮大豆，再装入容器内，于发酵室发酵使其变为纳豆，可说是一粒粒的纳豆上面有繁殖力的纳豆菌，不愧为一种艺术品。
装放充填工程所使用的容器是商品计划中预先决定的。现在市售制品的大部份装在浅盘(PSP角容器50-40g)或纸杯(纸杯容器40-30g) 。机械填充时靠机械
的部件(容器供应器，充填机的原料供给装置以及运送轨道)的各自调换而成为万能型自动填充机。
在少量生产用人手时，以有柄定量杯子将原料装放在容器内。自动充填机出现于70年代。之前都是用手工作业，但是要把全部量放好在发酵室内，再开始发酵，费时良久。这样难免有参差不齐的产品，充填作业的要领为顾及纳豆菌是好气性菌，要使纳豆菌繁殖旺盛及容易发散水分，不能把煮豆压太紧，而徐缓充填使粒子间有适当空间，如此才能顺利进行发酵。
至于决定商品形态，依各个市售地区的消费动向来决定。最近趋势为从少容量杯子商品转移为经济型浅盘商品，而且不只是双层、三层，甚至有诉求省钱，有膨满感的四层产品。
PSP角容器本身有隔热效果，使发酵稳定，保证良好质量的产品，又在冷藏熟成后运送过程中保持原来品质。另外，角容器在包装工程中靠由层迭包装机可包装
成两层、三层或四层的商品，如以纸杯装出品，就要有上盖封口机，衬纸供应器，缩小包装机的设备，加重负担。
表3-1显示纳豆包装容器的特性。其中各容器的保温，保水、通气等在发酵工程中所需机能各有千秋。因此一定要避免将不同种类的容器在同一发酵室内。一个发酵室只放一种容器，才能获优质纳豆。
表3-1　纳豆容器的特性
容器名称
使用材料
可否使用充填机以及卫生度
N工程中必要的机能
冷藏，物流保存
其它
可否使用
坚守性
卫生度
保温
保水
通气
保温
保水
坚牢度
餐具化
烧毁
PSP
纸杯
Plus cup
聚乙烯氯
塑料袋
Terappusu
薄板箱
Sudare
Tsuto
聚苯乙烯
纸
Hizeks(？)
乙烯氯
聚乙烯+薄板箱
用石蜡烃包覆的薄板箱
木材
稻草
稻草
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注：◎良好　○普通　△不太好　×不好
(6) 引入作业，原则上是大容器内摆单层
将装放充填好的容器引进发酵室称为引入作业，考虑到发酵室内温度，湿度的均匀分布，要选用良好通气性的大容器。把容器摆放在大容器时，原则上只放单层，如果要码放要交错摆放容器，而不能把上面容器正好摆在下面容器上，以避免发酵热的积蓄。大容器的堆高也有一定限度，在发酵室中，容器与发酵室墙之间至少要留10公分的距离，避免通风不好导致室内温度不均。期望每次都得到最佳结果，引入作业就要每一次，同一种类容器中有同一种原料，有同一充填量的容器，并且有同样数量的容器。
(7) 发酵工程──要点为温度以及温度管理
在纳豆制造工程中最重要的是发酵工程，如众所知，纳豆为短期熟成型产品，在短短15-16小时内质量已被决定。其要点为在工程前半段，使蒸煮大豆表面的纳豆菌充分繁殖，而在后半段，纳豆菌的酵素作用能充分发挥效果，造出纳豆特有的芳香和美味。如此，在发酵工程的管理上，要先熟悉纳豆菌特性和发酵的机能。之后才能操作好纳豆的生产。
现在的发酵室具备很多个温度和湿度计测器，可测定发酵室内的温度、湿度以及原料大豆的温度。因此有加温、冷却、加湿、除湿、供给气体、排气等机能。在自动控制盘上面可设定全部发酵工程的型式以获得理想的纳豆。另外它可自动作好全部过程的记录，提供质量管理的数据。工程进行前首P需要设定自动操控装置的程序，也就是要进行理想的前期，中间期，后期各阶段发酵的阶梯式参数设定。
在图3-13表示发酵工程过程的温度，湿度的管理型式，而这管理型式依原料大豆，包装材料不同而有所变化。一有变化，就得重新设定最佳型式。这需要经验的累积，依据以前设定条件及所产纳豆的质量的有关数据，要努力达到最佳状况。为了方便，纳豆发酵装置的自动控盘面板上分为：1)诱导2)发芽繁殖，将对数期，定态期表示为3)发酵，死灭期的表示为4)熟成，强制冷却。
①予冷(诱导期)
依据发酵大小和引入量多寡，预冷操作有所不同。在夏天外面气温高时，先调到室温30℃预冷1小时。之后再调到发芽繁殖温度。纳豆菌为了吸收养分须有水分当媒介。因此，对密闭度不完全的薄板箱容器，在诱导期须增加湿度。
②发芽繁殖(诱导期)
③发酵：
对数期──纳豆菌繁殖到达对数期时会产生大量的发酵热。平均大约经8小时就产生大量热，原料大豆温度即开始上升，到12小时其温度会突破50
图3-13　纳豆之发酵工程之温度、湿度管理

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℃ ，表面积较大的极小粒大豆或磨碎大豆等较快表现温度的上升。在此阶段因氧气需要量大，用给气，排气装置，一面提供空气，一面排出发酵代谢气体及水气。
定态期──以原形大豆来说，粘稠物在50-52℃ ，保持4-5小时即可产生，因此调节室温以便维持原料大豆的温度在50-52℃ 。高密闭容器会储存发酵热而提高原料大豆温度，此时就需要降低室温，反之开放性容器会散热，所以要提升室温。
④熟成强制冷却(死灭期)
一过定态期，马上要急速下降室温，降低原料大豆温度，以防再次繁殖所引发的去胺反应，就让熟成继续下去。有时，接种纳豆菌后18-20小时，就把物品从发酵室移到外面，一面散热，一面排气，将容器内代谢气体和外面空气交换，达到冷却、除湿的目的。温度降到室温时就搬进第一次冷藏库中。另外容器不一样时，发酵工程中温度、湿度管理方式也有改变。像纸杯、塑料、薄板箱等没有保温性的容器，发酵热传出，而原料温度的上升不高。这情况下酵素难于活性化，无法产生粘物稠。因此要上升室温，提高原料温度以利于进行理想发酵型式。对没有保水性质的容器就要增加湿度使其维持湿度。对没有通气性容器要事先穿针孔。
(8)冷藏熟成──必须在5℃以下低温
熟成一定是在5℃以下低温进行，在隔天作第二次包装或分类作业时，务必注意原料温度没有上升。之后的
运送过程中熟成继续进行，也要留意温度的控制，绝对不让纳豆菌继续繁殖。
(9) 第二次包装与出货──运送一定用冷藏库
表3-2　纳豆生产、出货所需日数
第１日
第２日
第３日
第４日
第５日
原　料
大　豆
水　洗
↓
浸　渍
蒸　煮
↓
接　种
↓
充　填
↓
N　酵
成为制品

向流通中心

→ 出纳豆
↓
一次
冷藏

→ 一次
冷藏
（０时）
↓
包　装
↓
二次
冷藏
↓
（６时）
出荷
↓
店　头

→ 二次
冷藏
↓
（６时）
出荷
↓
店　头
在第一次冷藏库冷却熟成的产品，从大容器取出后，经各种形态的第二次包装才成为商品。主流的包装形态为2-3层的PSP容器和3个缩小纸杯包装。经过包装的制品再装入大包纸箱，贮存于第二次冷藏库中。从前，纳豆被称为当日销售食品，亦即当天生产，当天出售，这是因为纳豆上面仍有活菌，在运送途中温度一上升，纳豆菌开始繁殖而产生氨，破坏了新鲜度。以前，业界使用Do名称，意识是刚生产的当天就送到消费者手中。
但现在，冷藏设备普遍使用于生产，流通，贩卖过程以及家庭中，把纳豆温度一直保持在5℃以下，结果可保存好多天。因此厂商标示保质期，保存方法等，给消费者有多种选择。
(10) 制品冷藏与运送过程须注意的事情
纳豆一直被定位为一种生鲜食品。冷冻机未普及之前，纳豆必定要在当天出售。现在制造纳豆的工厂都有生产在线的温度控制，彻底的冷藏出货前产品，运送过程使用冷冻车或冷藏车，而在超市就放在冷藏架上，到每个家庭就放进冰箱中，如此在低温进行的酵素反应使纳豆更为熟成，更为好吃