草丁图书馆

  1. 首页 > 生活杂烩 > >

par 环状RNA研究之PAR-CLIP

par 环状RNA研究之PAR-CLIP


文章图片

clip(uv-交联和免疫沉淀)是研究蛋白质与RNA相互作用的重要技术，它利用蛋白质与RNA在256 nm紫外光照射下的共价交联。但是，CLIP是一项很难掌握的技术。由于紫外交联效率很低(1%~5%)，交联RNA含量很少，RNA容易降解，RNA连接效率低，实验过程复杂(~100步)等。，这增加了应用CLIP的难度。
为了提高紫外交联效率，科学家开发了PAR-Clip(光活化-核糖核苷增强Clip)技术，可将交联效率提高100~1 000倍。这种方法最重要的一点是依靠光活性核糖核苷类似物，如4-硫尿苷，将它们插入活细胞中新生的RNA转录物中。在365纳米紫外灯照射的细胞中，光活性核糖核酸核标记的RNA被诱导与RBP相互作用。免疫沉淀所需的RBP，然后分离交联和共沉淀的核糖核酸。然后将核糖核酸转化为cDNA文库并进一步测序。使用4-硫尿苷时，交联序列会产生T-C转化，因此PAR-CLIP制备的cDNA文库可以准确定位交联位置。

par 环状RNA研究之PAR-CLIP


文章图片

驻车制动流程图
具体实验方法
★
试剂制备
▲ 1.4-硫尿苷储存溶液(1 M): 260.27毫克4-硫尿苷，1毫升二甲基亚砜
▲ 2.多西环素储存溶液(10毫克/毫升):10毫克多西环素，1毫升二甲基亚砜
▲ 3.5× NP40裂解物:制备5×不含DTT和蛋白酶抑制剂的储存溶液，50毫米HEPES (pH 7.5)，150毫米KCl，2毫米乙二胺四乙酸，1毫米氟化钠，0.5%(体积比)NP40
▲ 4.柠檬酸-磷酸盐缓冲液:4.7克/升柠檬酸，9.2克/升Na2HPO4，酸碱度5.0
▲ 5.离子交换树脂洗涤缓冲液:50毫米Hepes-KOH (pH 7.5)，300毫米KCl，0.05%(体积比)NP40
▲ 6.高盐洗涤缓冲液:50毫米Hepes-KOH (pH 7.5)，500毫米KCl，0.05%(体积比)NP40
▲ 7.脱磷缓冲液:50毫米tris-HCl (pH 7.9)，100毫米NaCl，10毫米氯化镁和1毫米DTT
▲ 8.磷酸酶洗涤缓冲液:50 mm tris-HCl (pH 7.5)，20mm/review/试剂/EGTA.html EGTA，0.5% (v/v) NP40
▲ 9.无差热分析的多核苷酸激酶缓冲液:50毫米tris-HCl (pH 7.5)，50毫米氯化钠，10毫米氯化镁
▲ 10.PNK缓冲液:50毫米三盐酸(pH 7.5)，50毫米氯化钠，10毫米氯化镁，5毫米差热分析
▲ 11.十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳加载缓冲液:10%甘油(v/v)，50 mM三盐酸(pH 6.8)，2 mM乙二胺四乙酸，2%十二烷基硫酸钠(w/v)，100 mM差热分析，0.1%溴酚蓝
▲ 12.2×蛋白酶k缓冲液:100mm tris-HCl (ph7.5)，150mm NaCl，12.5mm EDTA，2% (w/v) SDS
▲ 13.实验前直接向5× NP40裂解液、IP洗涤缓冲液和高盐洗涤缓冲液中加入0.5 mM DTT和无EDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏)。
★
实验过程
01
细胞培养和体外交联
1)将增殖细胞在培养皿中培养(15cm培养板，需要20-50块板)，培养至饱和度为80%。
2)将4-硫尿苷直接加入到细胞培养液中，最终浓度为100 μ m
3)交联后14小时，在每个平板中用10毫升预冷的1×PBS洗涤细胞一次，然后完全除去PBS。
4)将培养板放在有冰的托盘上，在0.15 J/cm2、365nm的紫外灯下照射。
5)向培养板中加入1毫升1× PBS，用橡胶棒刮去细胞，将细胞转移到50毫升离心管中，在4℃离心500克5min，除去上清液。
02
核糖核酸酶T1消化
1)向沉淀的细胞中加入3倍体积的1×NP-40裂解缓冲液，并在冰上静置10分钟。
2)将细胞裂解物在13000克和4℃下离心15分钟，弃去沉淀物。
3)用0.2um膜注射器过滤器进一步清洗细胞裂解物。
4)将RNase T1加入到最终浓度为1U/μl的溶液中，并在22℃的水浴中孵育15分钟。然后让它在冰上反应5分钟。

推荐阅读


上一篇：新生儿卡介苗接种时间 卡介苗什么时候打？

下一篇：邪恶漫画天堂 墙上画满了邪恶漫画，却成为岛城最治愈的餐厅~