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要问一抗孵育时间不能超过多久 ， 据悉一抗的孵育时间与温度、抗体浓度有关 。 一般情况下 ， 在37℃的条件下 ， 孵育1-2小时左右 。 在室温的条件下 ， 孵育3小时左右 。 在4℃的条件下 ， 孵育18-24小时左右 。 如果一抗的浓度过高或者是孵育时间过长 ， 会导致非特异性吸附 ， 增加洗涤的难度 ， 最终因洗涤不彻底而出现非特性显色 。
一、一抗孵育时间 ， 不能超过多久
1、一抗的定义
一抗指的是能够和非抗体性抗原（特异性抗原）特异性结合的蛋白 ， 也就是平常所说的抗体 。 二抗指的是能和抗体结合的抗体 ， 主要用于检测抗体的存在 ， 放大一抗的信号 。
2、一抗的孵育时间
（1）一抗的孵育时间与温度 ， 抗体浓度有关 。 一般情况下 ， 在37℃的条件下 ， 孵育1-2小时左右 。 在室温的条件下 ， 孵育3小时左右 。 在4℃的条件下 ， 孵育18-24小时左右 。
【一抗孵育时间不能超过多久】（2）如果一抗的浓度过高或者是孵育时间过长 ， 会导致非特异性吸附 ， 增加洗涤的难度 ， 最终因洗涤不彻底而出现非特性显色 。
二、双抗体夹心法检测未知抗原
1、包被
用0.05M碳酸盐包被缓冲液（ph9.6）对抗体进行稀释 ， 直至蛋白质含量为1-10μg/ml为止 。 在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml ， 4℃过夜 。 第二天的时候 ， 去掉孔内溶液 ， 然后用洗涤缓冲液洗3次 ， 每次3分钟 。
2、加样
将0.1ml经过稀释的待检样品放到反应孔中 ， 在37℃的环境条件下孵育1小时 ， 然后进行洗涤 。
3、加酶标抗体
在各个反应孔中 ， 加入0.1ml新鲜稀释的酶标抗体 ， 在37℃的环境条件下 ， 孵育0.5-1小时 ， 然后进行洗涤 。
4、加底物液显色
在各个反应孔中 ， 加入0.1mlTMB底物溶液（应当临时配制） ， 37℃的环境条件下10-30分钟 。
5、终止反应
在各个反应孔孔中 ， 加入0.05ml的2M硫酸 。
6、结果测试
（1）在白色背景下 ， 用肉眼进行观察即可 。 反应孔内颜色越深 ， 阳性程度越强 ， 阴性反应为无色或极浅 。
（2）在ELISA检测仪上 ， 于450nm（若以ABTS显色 ， 则410nm）处 ， 以空白对照孔调零后测各孔O·D值 ， 如果大于规定的阴性对照OD值的2.1倍 ， 即为阳性 。
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